جهاز الإضاءة فوق البنفسجية: اختيار واستخدام النظام المناسب لتصوير الجل

النتيجة إشكالية هي جهاز الإضاءة الفوقفوقية. يقرأ الحمض النووي النووي، الحمض النووي الريبي أو أشرطة البروتين بطريقة بسيطة، عن طريق تمرير الضوء فوق البنفسجي عبر جل مصبوغ. يمكن للمشغل بعد ذلك فحص الهلام، أو التقاط صورة له، أو قص الشريط المطلوب للعمل عليه لاحقا.

معظم المشاكل تتعلق بمشاكل أخرى غير مفتاح الطاقة. هذه الناتجة عن عدم الطول الموجي، وعدم توافق الإضاءة والبقع، والتعرض الطويل جدا، ونقص الحماية من الأشعة فوق البنفسجية.

يجب أن يوفر سير عمل جيد لجهاز الترانسمولينيماتور UV نطاقات واضحة، مع أقل قدر ممكن من التعرض للعينة والشخص الذي يستخدم الآلة.

كيف يعمل جهاز الإضاءة فوق البنفسجية

ثم يتم تحويل الهلام للتحليل الكهربائي، تاركا وراءه شظايا جزيئية عادة لا ترى بالعين المجردة. صبغة فلورية تلتصق أو تتفاعل مع المادة المراد صبغها. ثم ينقل الجل المصبوغ إلى السطح المضيء، ويتم تحفيز الصبغة بفعل الضوء فوق البنفسجي وتصدر فلورة يمكن رؤيتها بالعين.

الخلفية الداكنة والأشرطة الساطعة تتيح لك تقريب حجم الشظايا، ومقارنة شدة العينات، وفحص منتجات التضخيم أو إيجاد مادة لاستخراج الجل.

تتوفر عدة أجهزة إضاءة فوق بنفسجية عند أطوال موجية قياسية 254 و302 و365 نانومتر. بعضها يقدم طول موجة واحد، وبعضها يقدم اثنين أو ثلاثة؛ أيها الأفضل يعتمد على نوع الجهاز والطول الموجي المطلوب. تستخدم تطبيقات الرؤية الهلامية والرحلان الكهربائي نطاق واسع من الأشعة فوق البنفسجية بالقرب من 302 نانومتر.

اختر الطول الموجي للتطبيق الفعلي

تتأثر شدة الفلورة، والتلف في العينة، وتوافق الصبغة باختيار الطول الموجي.

غالبا ما يستخدم مصدر 302 نانومتر عند مشاهدة جل الحمض النووي والحمض النووي الريبي المصبوغ بالفلورية لأنه يعطي عادة إشارة عالية الشدة، ويمكن استخدام العديد من صبغات الأحماض النووية المعروفة مع هذا المصدر. حل سهل لفحص الجل الروتيني والتوثيق.

إذا كان تقليل تلف الحمض النووي الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية أهم من أقوى إشارة ممكنة، فقد يعتبر استخدام الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة، والتي تقترب من 365 نانومتر. ينصح ثيرمو فيشر بتقليل التعرض للحمض النووي ويقترح استخدام طول موجي أطول (حوالي 360 نانومتر) إذا تم استخراج الحمض النووي من الهلام.

لا ينبغي اعتبار استخدام الأشعة فوق البنفسجية القصيرة الموجة (بالقرب من 254 نانومتر) للمشاهدة الروتينية لهلام الحمض النووي تلقائيا، رغم توفر بعض أجهزة الترانسلينوميتور المختبرية. ويعتبر مناسبا للاستخدام حسب المادة الفلورية والتطبيق في المختبر.

لذا، فإن أكبر طول موجي ليس الخيار الأكثر فعالية. هو الذي يناسب الصبغة ويحافظ على العينة بشكل كاف للخطوة التالية.

استخدم لون مختلف من صبغة الجل كمصدر ضوء بلون مختلف

يجب اعتبار جهاز الإضاءة الناقل والصبغة الهلامية كنظام بصري واحد.

هناك أنواع مختلفة من الأصباغ ذات خصائص مختلفة في الإثارة والانبعاث. قد يكون للصبغة انعكاس عالي للأشعة فوق البنفسجية، وانعكاس منخفض للضوء الأزرق، والعكس صحيح. يجب أن يسمح مرشح الكاميرا أيضا بمرور الفلورة المنبعثة ومنع مرور الإشعاع المثير غير المرغوب فيه.

قبل اختبار جديد:

• الأطوال الموجية التي تحفز الصبغة هي الليكيل. الأطوال الموجية التي تثير الصبغة هي 'لويكويلز'.
• قرار استخدام مرشح فوتوغرافي يعتمد على المصور الفردي.
• خصائص المادة الملطخة (DNA، RNA أو البروتين)
• إذا كان الجل سيقطع أم لا، كيف سيتم توثيقه؟
• إذا كان مصدر الضوء تقنية جديدة، هل هناك طريقة لالتقاطه باستخدام نظام التصوير الحالي؟

على سبيل المثال، يمكن تصوير جل SYBR Safe المصبوغ باستخدام معدات فلورية مناسبة مع فلتر ضوء فوق بنفسجي أو أزرق - فلتر المستخدم في تصوير الإيثيديوم-بروميد قد لا يكون مناسبا.

إذا كانت الصورة باهتة جدا، فهذا لا يعني بالضرورة أن هناك عددا قليلا جدا من الحمض النووي في الهلام. قد يكون السبب طول موجة إثارة غير مناسب، أو فلتر كاميرا خاطئ، أو مصابيح UV قديمة مستخدمة، أو الكثير من ضوء الغرفة.

إذا تم استرداد الضرر في الحمض النووي، قلل من التعرض للأشعة فوق البنفسجية

الأحماض النووية عرضة للتلف من قبل أشعة الأشعة فوق البنفسجية. وهذا مهم إذا رغب الباحث في استخراج شريط DNA من الجل واستخدام الحمض النووي المتبقي في تطبيقات لاحقة مثل الاستنساخ، الربط، التسلسل، أو تطبيقات أخرى.

التعرض الطويل قد يؤدي إلى خدش الحمض النووي بالإضافة إلى أضرار أخرى، مما يؤثر على جودة الحمض النووي المسترجع. يشير ثيرمو فيشر إلى أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية لفترات طويلة قد يؤدي إلى تلف في الحمض النووي قد يؤثر على التطبيقات اللاحقة مثل الاستنساخ الفرعي.

في حال الحاجة إلى التصوير بالأشعة فوق البنفسجية:

1. قم بتركيب أدوات القطع وأنبوب الجمع قبل تشغيل الضوء.
   1. اضبط أدنى إعداد ينتج نطاقا شفافا.
   1. يجب تقليل التعرض إلى الحد الأدنى.
   1. إذا أمكن، فكر في طول موجي أطول للضوء فوق البنفسجي.
   1. لا تشاهد نفس الجل مرارا وتكرارا.
   1. سجل الشريط المختار وأوقف المصدر.

قد يكون جهاز الإضاءة الزرقاء المتوافق مع الاستنساخ أكثر ملاءمة لأعمال الاستنساخ الحساسة بشكل خاص. يمكن أن تثير الألوان بفعل الضوء الأزرق، وقد وجد أن ضررا أقل يتعرض للحمض النووي بواسطة الضوء الأزرق.

تحقق من توحيد الإضاءة

يجب أن يوفر جهاز الإضاءة الناقل إضاءة موحدة للمنطقة التي سيتم مشاهدتها.

إذا كان أحد جانبي السطح أكثر كثافة من الآخر، فإن الأشرطة المتطابقة ستكون تختلف في شدتها حسب موقعها على الجل. وهذا مهم بشكل خاص عند مقارنة المسارات في نفس المختبر و/أو عند استخدام صورة للتحليل شبه الكمي.

يتأثر التوحيد بحالة المصابيح، وترتيب المصابيح، والفلاتر، ونظافة الأسطح، والتصميم البصري للجهاز. الإضاءة الموحدة مهمة في سياق الأشعة فوق البنفسجية لتحقيق تكرار النتائج في النطاقات والمسارات المختلفة.

دائما افحص الخلفية لترى إذا كانت متساوية طوال الجل بالكامل، قبل أن تعتمد على شدة الشريط. نقل نفس الجل إلى جزء مختلف من السطح قد يساعد في تطوير مشكلة الإضاءة.

استخدم منطقة المشاهدة الصحيحة

يجب أن تكون مساحة السطح المضاءة كافية لتغطية الجل دون أن تشغل مساحة إضافية في المقعد.

الخلية الصغيرة رائعة للجلات الصغيرة العادية. المنصات الأكبر ستكون أفضل للجل الكبير الحجم أو الجل المتعدد جنبا إلى جنب. تتوفر أنظمة تجارية بمناطق مضاءة مختلفة، عادة بحجم حوالي 20 × 20 سم أو أكثر.

يجب أن يكون كل الجل مسطحا على السطح. الانعكاسات وضبابية الأشرطة قد تكون بسبب التجاعيد في الطبقة الواقية، أو وجود طبقة مؤقتة زائدة، أو صينية غير متساوية.

تأكد من نظافة سطح العرض؛ استخدم فقط المواد ومواد التنظيف المتوافقة مع فلتر الأشعة فوق البنفسجية. قد تتأثر الصور بالخدوش أو البقع أو ترسبات المخزن الجاف.

تأكد من حماية المستخدم من التعرض للأشعة فوق البنفسجية

جهاز الإضاءة فوق البنفسجية ليس مصباح مشاهدة قياسي، بل هو مصدر ضوء عالي الشدة مصمم للاستخدام في المختبر.

التعرض المباشر أو غير المباشر للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يؤدي إلى تلف العين والجلد. تدرج إرشادات السلامة المختبرية في ستانفورد الاحتياطات التالية لاستخدام جهاز الإضاءة الناقل: الحفاظ على الوصول إلى جهاز الإضاءة تحت السيطرة أثناء استخدامه، وإبقاء الأسطح العاكسة بعيدا عن جهاز الإضاءة الناقل، ووضع لافتات تشير إلى ضرورة حماية الجلد والعينين.

استخدم دائما الغطاء الواقي أو الدرع أو خزانة التصوير المغلقة المرفقة مع الآلة. قد تتطلب الممارسات المخبرية التي تتطلب العمل بالجل تغطية الوجه، وارتداء القفازات، ومعطف المختبر المثبت، وتغطية الجلد بمثبطات الأشعة فوق البنفسجية.

لا تفترض أن نظارات الأمان العادية تحجب طول موجة الأشعة فوق البنفسجية. ارتداء معدات الحماية المناسبة المخصصة للجهاز والالتزام بقواعد السلامة الإشعاعية في المختبر.

يتم تحقيق تحكم أفضل في التعريض باستخدام نظام توثيق هلام مغلق مع قفل أمان بدلا من العمل فوق صندوق إضاءة مفتوح. بعض الأنظمة لا تسمح بفتح باب التصوير أثناء التشغيل في وضع الأشعة فوق البنفسجية.

يجب على المعلمين وضع سير عمل متسق للمشاهدة

هناك مسار بسيط يمكن استخدامه لتقليل التغيرات غير الضرورية:

• الرحلان الكهربائي والتلوين 1. الرحلان الكهربائي و1 صبغ.
• تأكد من أن الصبغة بنفس الطول الموجي الصحيح.
• تأكد من أن سطح صينية الجل نظيف وجاف.
• اختر الطول الموجي وشدة الأشعة فوق البنفسجية المطلوبة.
• ضع الجل على منطقة المشاهدة في المنتصف.
• أغلق الدرع الواقي/صندوق التصوير.
• استخدم أقصر وقت تعريض ممكن لإنتاج أحزمة مرئية.
• التقط الصورة باستخدام فلتر الانبعاث المناسب.
• أطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند تحريك الجل.
• امسح السطح بعد الاستخدام.

إذا أجريت عدة تجارب، يجب أن يكون تركيز الصبغة نفسه، وكذلك فلتر التصوير، ووقت التعريض، وضبط الشدة، وظروف الكاميرا.

توصيل جهاز الترانسلمويميتور في سير عمل التصوير

إذا لم يكن المستخدم بحاجة لفحص الجل، يمكن استخدام جهاز الترانسلينيمينغ على سطح الطاولة. للتطبيقات الأكثر تطلبا، هناك حاجة إلى نظام توثيق هلام كامل يشمل كاميرا، وغلاف مظلم، ومرشحات، وبرامج تحليل الصور.

يمكن استخدام الأنظمة المتكاملة لالتقاط الصور، وقياس النطاق، والتوثيق، والتحليل المنتظم للجل. يتميز Bio-Rad بمنصات التوثيق الجلية، التي تتميز بإضاءة محكومة وبرامج التقاط وتحليل الصور تلقائيا.

القرار سيعتمد على ما سيفعله المختبر بالصورة. في مختبر البحث، قد يحتاج مختبر التدريس إلى تأكيد بصري واضح، وقد يحتاج مختبر البحث إلى ملفات صور قابلة للتتبع، وتعريض متسق، وتحليل النطاق الكمي.

لا تزيل مصدر الضوء أبدا

حتى لو بدت مصابيح الأشعة فوق البنفسجية وكأنها مضاءة، فإنها تبدأ في فقدان طاقتها مع الوقت. مع تقليل الشدة، سيزيد المشغل من زمن التعريض، مما قد يؤدي إلى تقليل الاتساق وزيادة تعريض العينة.

اتبع إرشادات صيانة المصباح من الشركة المصنعة. مقياس الإشعاع فوق البنفسجي سيكون مقياسا أكثر موضوعية من التقدير البصري، وقد حدد UVP أن قياس الإشعاع هو طريقة مناسبة لمراقبة العمر الافتراضي لمصدر الأشعة فوق البنفسجية.

غير المصابيح كمجموعة إذا كان التوصية، ونظف فلتر العرض جيدا وسجل مواعيد الصيانة. يمكن أن تحتوي مصابيح الأشعة فوق البنفسجية الفلورية أيضا على الزئبق ويجب التعامل معها والتخلص منها كنفايات خطرة حسب المتطلبات المحلية.

استنتاج

عند استخدام جهاز الإضاءة فوق البنفسجية لرؤية الجل، يمكنه القيام بذلك بسرعة ووضوح، لكنه لا يمكن أن يكون ساطعا فقط في ضوء فوق البنفسجي للحصول على نتائج جيدة.

يجب أن يكون الطول الموجي مناسبا للاستخدام للصبغة والاستخدامات اللاحقة. يجب أن تكون الإضاءة متجانسة قدر الإمكان، والتعريض قصير قدر الإمكان، ويجب أن يكون فلتر الكاميرا مماثلا للفلورة المنبعثة، ويجب أن يكون المستخدم محميا من التعرض للأشعة فوق البنفسجية من مصدر الضوء.

الجهاز المناسب هو الذي يستوعب حجم الجل، وطريقة التلوين، ومتطلبات التصوير، وسير العمل لاسترجاع العينات، وضوابط السلامة لبيئة المختبر.

الأسئلة الشائعة

س1. يستخدم جهاز الإضاءة فوق البنفسجية لأي غرض؟

يستخدم بشكل أساسي لتصوير شرائط الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين المصبوغ الموسوم بالفلورية في هلام الرحلان الكهربائي. يمكن أيضا دمجه في نظام توثيق الجل.

س2. أي من الأطوال الموجية التالية يستخدم عادة لجيلات الحمض النووي؟

الاستخدام الشائع للأشعة فوق البنفسجية المتوسطة (بالقرب من 302 نانومتر) هو للمشاهدة الروتينية للجل. يجب أن يكون الاختيار النهائي مشابها للصبغة، وكذلك التطبيق في مرحلة لاحقة.

س3. هل يغير ضوء الأشعة فوق البنفسجية الحمض النووي؟

نعم. قد يسبب التعرض الطويل تلف الحمض النووي ويقلل من قابلية الاستنساخ للحمض النووي والتطبيقات التالية.

س4. أيهما أكثر فعالية: الضوء الأزرق أم الأشعة فوق البنفسجية؟

إذا كان ضرر الأشعة فوق البنفسجية للمستخدم و/أو تلف الحمض النووي مصدر قلق، ينصح باستخدام الضوء الأزرق للحصول على الصبغات المتوافقة. حتى مع بعض البقع المعروفة، قد تعطي الأشعة فوق البنفسجية إثارة أفضل.

س5. لماذا هناك ضعف في أساور الجل؟

من المرجح أن يكون ذلك بسبب انخفاض تركيز العينة، أو صبغة غير مناسبة، أو طول موجي أو فلتر غير مناسب، أو تقدم عمر المصابيح، أو كثرة الضوء الخلفي، أو تلوين سيء.