نظام التصوير البيولوجي الجزيئي: اختيار المنصة المناسبة للهلام والبلات

يوفر نظام التصوير الجزيئي لعلم الأحياء مخرجا رقميا من هلام أو غشاء يمكن مشاهدته وقياسه وتخزينه ومقارنته. يمكن إعداده لمسح الجل الذي يحتوي على الحمض النووي النووي والحمض النووي الريبي، وجل البروتين المصبوغ، والبقع الغربية المضيئة الكيميائية، والبقع الفلورية، وعينات الألوان اللوني.

يجب استخدام نظام ليتناسب مع الاختبار وليس العكس.

كيف يعمل نظام التصوير البيولوجي الجزيئي؟

يشمل نظام التصوير القياسي غرفة محكمة الضوء، كاميرا، عدسة، مرحلة عينة من النار، مصادر ضوء يمكن استخدامها للإثارة المطلوبة، مرشحات تسمح له بتمرير الضوء فقط بتردد معين من الانبعاث، برنامج لتسجيل الصورة، وبرنامج لتحليل الصورة.

في حالة الهلام الأحماض النووية، يسلط الجهاز الضوء فوق البنفسجي أو الأزرق أو أي ضوء مناسب آخر على صبغة فلورية. يستخدم الضوء الأبيض كثيرا في هلام البروتين المرئي. الضوء الناتج في بقع الغرب المضيئة كيميائيا هو من صنعها الخاص ويأتي من تفاعل كيميائي، لذا هناك حاجة لكاميرا حساسة وغرفة تصوير مظلمة، لكن ليس لشدة عالية من الضوء على العينة.

بعض المنصات الشاملة تحتوي على قدرات توثيق الجل، والتصوير اللوني، والإضاءة الكيميائية، والفلورة في غلاف واحد. على سبيل المثال، يوفر Bio-Rad أنظمة لتصوير هلام الأحماض النووية والبروتينية وكتل الإضاءة الكيميائية، ويمكن توسيع هذه الأنظمة بقناة مرئية، وقنوات فلورية حمراء بعيدة، وقنوات فلورية قريبة من الأشعة تحت الحمراء.

يمكنك البدء بالعينات التي تديرها

أول مكان للبدء هو على طاولة المختبر - وليس في ورقة المواصفات!

بالنسبة لمختبر تعليمي يركز بشكل أساسي على جل الأجاروز، قد تكون الأنواع الوحيدة المطلوبة هي التصوير بالأشعة فوق البنفسجية والضوء الأزرق والأبيض فقط. يتطلب مختبر أبحاث البروتين الدقيق تلألؤا كيميائيا دقيقا وعددا من قنوات الفلورسنت.

تقسم ثيرمو فيشر أنظمة التصور الخاصة بها إلى تلك التي توفر التصور البسيط وتلك التي توفر تحليلا برمجيا بالإضافة إلى التصوير الفلوري متعدد القنوات الكيميائي بتقنية اللوتل الغربي والفلوري. تذكير مفيد: نظام توثيق الجل ليس بالضرورة مستوى من الأدوات مثل التصوير الجزيئي متعدد الأوضاع.

طابق مصدر الإثارة والفلتر مع الصبغة

كل صبغة فلورية لها نطاق أمثل من الأطوال الموجية لإضاءتها وانبعاث الضوء. يجب أن يكون نظام التصوير مجهزا بمصدر ضوء مناسب لتحفيز الصبغة، ومرشح انبعاث يسمح لفوتونات الانبعاث (الفلورية) بالوصول إلى الكاميرا مع رفض الضوء المستخدم لإثارة الصبغة.

فيما يلي أمثلة على أنظمة يمكن أن تحتوي:

• الإضاءة النفاذية فوق البنفسجية
• الإضاءة الانتقالية بالضوء الأزرق
• الضوء الأبيض المنقول
• الضوء الأبيض المنعكس
• إثارة فلورية مرئية
• الإثارة الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء

لا يوجد ارتباط بين عدد مصدر الضوء وجودته. المفتاح هو ما إذا كانت الأطوال الموجية والفلاتر المثبتة متوافقة مع الصبغات والأجسام المضادة والملصقات الفلورية المستخدمة بالفعل في المختبر.

تحقق من قائمة المواد المختصة للمختبر قبل شراء النظام للتأكد من أنه مدعوم من قبل التطبيقات. يرجى العلم أن ليس كل الأصباغ الفلورية يمكن التقاطها لأن النظام يشار إليه باسم "جهاز تصوير الفلورة".

الإضاءة الكيميائية والفلورة متشابهتان جدا

في الطلاء الغربي المضيء الكيميائي، يتم توليد الضوء من خلال تفاعل كيميائي مضيء عادة ما يعتمد على إنزيم الأجسام المضادة وركيزة مضيئة. ستتغير الإشارة مع الوقت – يجب بدء التصوير ضمن نطاق الوقت الموصى به للكاشف.

البلويت الغربي الذي يتم بواسطة الفلورية يتطلب الضوء الخارجي للمثارة. يمكن استخدامه في التجارب، وبالتالي يمكن اكتشاف عدة أهداف على نفس الغشاء عبر قنوات فلورية مختلفة.

يستخدم التلميع الكيميائي عادة للكشف الحساس والروتيني. عندما يكون التعدد أو التقاط الإشارة المستقرة أو المقارنة الكمية أمرا حاسما، غالبا ما يختار الفلورة. لا توجد طريقة واحدة أفضل، حيث يعتمد ذلك على متطلبات الاختبار، وكمية الهدف، والأجسام المضادة، والتسميات المستخدمة، وأهداف التحليل.

إذا كان المختبر يجري كلا الاختبارين بشكل روتيني، يجب أن يضمن أن النظام المقترح سيسمح بإجراء الاختبارات كما هي ودون الحاجة إلى تغييرات معقدة في الأجهزة.

عند التصوير، ضع في اعتبارك النطاق الديناميكي والتشبع

قد يكون لدى بعض البقعة شريط قوي جدا وعدد من الأشرطة الضعيفة. قد يصبح النطاق القوي مشبعا إذا كان التعريض طويلا بما يكفي لإظهار الإشارات الخافتة.

عندما يكون هناك الكثير من الضوء بحيث لا تستطيع بكسلات الكاميرا التقاطه. بعد تلك النقطة، سيبقى وضوح الشريط المعروض الظاهري، لكن مستوى الشدة لن يستخدم للمقارنة الكمية.

النطاق الديناميكي هو نطاق الإشارات الضعيفة إلى القوية التي يستطيع نظام التصوير تسجيلها في صورة واحدة. النطاق الديناميكي الأكبر يسمح بتسجيل أسهل للأشرطة الخافتة والمكثفة دون فقدان أي من المعلومات.

بعض منصات التصوير يمكنها اكتشاف البكسلات المشبعة، أو اقتراح تعريض مناسب، أو استخدام تعريضات متعددة. يمكن أن تقلل من عدد التصوير بالتجربة والخطأ، لكنها ليست بديلا عن تصميم تجريبي جيد. حتى لو كانت العينات محملة بشكل زائد، يجب تصحيحها خلال مرحلة الاختبار، ويجب تصحيح إشارات الأجسام المضادة القوية جدا أيضا.

يجب تجنب استخدام التعريض التلقائي

يمكن أن يكون التعريض التلقائي مفيدا إذا كان عدة أشخاص يتناوبون على الآلة، أو إذا كانت هناك عوامل قد تجعل من الصعب قياس قوة الإشارة.

بعض الأنظمة ستحصل على تعريضات أولية قصيرة ثم تقترح تعريضا عاما بناء على ذلك. يتم اختيار مصادر الضوء والتركيز وإعدادات التطبيق تلقائيا من قبل الآخرين.

قد يسمح ذلك بالتصوير الروتيني بشكل أسرع، لكن يرجى التحقق من قبل المشغل. تحقق مما إذا كن:

• ملاحظة: التشبع يشار إليه للأشرطة المهمة.
• يمكن رؤية أشرطة ضعيفة فوق الخلفية
• يغطي العينة الكاملة كامل مجال الرؤية.
• للحصول على أفضل النتائج، تم استخدام وضع التصوير الصحيح.
• تم استخدام الفلتر والصينية اللازمة
• ما يلي هو التحليل الكمي ويتطلب بدلات التعرض:

الإعدادات التلقائية نقطة انطلاق جيدة، لكنها ليست عذرا لعدم فحص الصورة.

تأكد من أن الدقة والحساسية ومجال الرؤية كلها صحيحة

الدقة مهمة للصورة التي تلتقطها الكاميرا، لكن عدد الميجابكسل ليس مؤشرا على جودة التصوير في الكاميرا.

من المهم أيضا وجود نظام مفيد حساس بما فيه الكفاية، وخلفية منخفضة، وبصريات جيدة، وموحدا، ومجال رؤية واسع بما يكفي لاستيعاب الهلام أو الأغشية المستخدمة في المختبر.

إذا كانت إشارات الإضاءة الكيميائية ضعيفة، فستكون هناك حاجة لكاميرا شديدة الحساسية. كلما زادت المسافة بين النطاقات، قلت الحاجة للدقة؛ كلما قل البعد بين النطاقات وزادت أهمية الدقة، وكلما صغرت الميزة في العينة التي سيتم فصلها، زادت الحاجة إلى دقة.

ضع أكبر صينية جل مختبرية، أو صينية بلوت، أو صينية متعددة الجل في موقع التصوير قبل الشراء. إذا تم تقطيع جل كبير إلى عدة صور، فهذا يعني أن الجهد يضيع وستكون المقارنات أكثر صعوبة.

تأكد من التقاط الصور بشكل منتظم

يوصى بالتقاط الصور تحت نفس الظروف عند مقارنة الصور.

اكتب وضع التصوير، نوع مصدر الضوء، الفلتر، وقت التعريض، التخزين، التركيز، موقع العينة، إعدادات التحليل، والخلفية وأي تصحيح خلفي. إذا لزم الأمر، أعد استخدام البروتوكولات التي تم حفظها.

إذا كنت تصبغ أو تصبغ، تأكد من أن الظروف متشابهة مع حمض النووي وجل البروتين. التحكم في تحميل عينات الضابط، وتركيز الأجسام المضادة، ووقت الركيزة، والتعامل مع الغشاء في البقع الغربية.

المصور سيتمكن فقط من تسجيل العينة التي تم وضعها فيها. لا يمكنه إصلاح النقل غير المتساوي، أو كثرة الخلفية، أو زيادة التحميل في المسارات، أو نقص خصوصية الأجسام المضادة.

اختبر برنامج التحليل

المهام الشائعة لا يجب أن تكون صعبة في برامج تحليل الصور، ولا ينبغي أن تحجب البرمجيات إنتاج النتيجة.

بعض الوظائف الذكية قد تكون:

• اكتشاف المسارات والنطاقات
• تقدير الوزن الجزيئي
• طرح الخلفية
• قياس شدة النطاق
• تحذيرات التشبع
• التطبيع
• عرض القنوات متعددة
• تعليق الصور
• تصدير البيانات
• عندما يتم تسجيل المستخدم أو التجربة.

التحليل المدمج ميزة للأعمال الروتينية، وقد تكون برامج سطح المكتب أكثر ملاءمة للتحليل التفصيلي وكذلك لإعداد الرقم النهائي. على سبيل المثال، توفر أنظمة التصوير الحراري الصياد عمليات اقتناء وتحليل على متن السفينة، وسير عمل برمجيات خارجية.

احتفظ بملف الصورة الأصلي كما هو دائما طالما استطعت. تعديل الصورة المعروضة لا يجب أن تستبدل بيانات الاستحواذ الخام.

تأكد من اتخاذ الاحتياطات واتخاذ خطوات إضافية لضمان سلامة عيناتك

من المهم توفير الحماية المناسبة لأن الضوء فوق البنفسجي المباشر أو المنعكس الذي ينبعث من جهاز التصوير فوق البنفسجي قد يسبب ضررا للعينين والجلد. يمكن تقليل التعريض عن طريق إغلاق غرفة التصوير التي تكون أقل مقارنة بصندوق الأشعة فوق البنفسجية المفتوح.

إذا كان من المقرر استخراج الحمض النووي من الجل، فقد يكون استخدام الإثارة بالضوء الأزرق أفضل لصبغات الأحماض النووية المناسبة. التصوير بالضوء الأبيض يلغي استخدام الأشعة فوق البنفسجية لرؤية بقع البروتين المرئية.

يجب أيضا تصميم النظام لضمان منع التلوث من عينة إلى أخرى. اغسل صواني العينات، وتخلص من انسكابات المخزن في أسرع وقت ممكن، واتبع إرشادات الشركة المصنعة لتنظيف الفلاتر والعدسات وأسطح التصوير.

تأكد من أن النظام مهيأ كأداة بصرية

لا يمكن تنظيف جهاز تصوير البيولوجيا الجزيئية مرة واحدة فقط.

تتآكل مصادر الضوء مع مرور الوقت، وقد تتعرض الفلاتر للخدش، وقد تتلطخ صواني العينات، وقد يؤثر الغبار على جودة الصورة. يجب على المختبرات تتبع الإضاءة، وفحص الصواني والفلاتر، وأخذ نسخ احتياطية من بروتوكولات الاستحواذ، وتحديث البرامج بعناية، والحفاظ على توثيق الصيانة.

عندما تكون جودة الصورة غير جيدة، قم بالمرور بالعملية كاملة وانظر إذا كانت هناك مشكلة في الكاميرا أو بقية السلسلة. قد يكون السبب هو الصبغة، أو العينة أو الركيزة، أو إعدادات التعريض، أو مصدر الضوء، أو الفلتر.

استنتاج

المنصة الأكثر فائدة ليست دائما هي التي تحتوي على أكبر عدد من الميزات. وهي التي توفر الإضاءة والحساسية والنطاق الديناميكي والبرمجيات ومنطقة التصوير وسير العمل المناسبين التي يمكن للمستخدمين الآخرين إعادة إنتاجها.

يبدأ التصوير الجيد من مرحلة تحضير العينة. تسجل الأداة التجربة، ولكن إذا تم إعداد الاختبار بعناية وتم الاستحواذ بشكل متكرر، فإن الصورة (التسجيل) تكون ذات معنى.

الأسئلة الشائعة

س1. ما الذي يمكن أن يلتقطه نظام التصوير البيولوجي الجزيئي؟

يستطيع التقاط هلام الحمض النووي وRNA، وجل البروتين، والبقع الغربية المضيئة الكيميائية، والبقع الغربية الفلورية، والأغشية اللونية حسب الإعدادات.

س2. ما الفرق بين نظام توثيق الجل وجهاز تصوير البقعة الغربية؟

ليس دائما. قد يدعم نظام الهلام الأساسي فقط التصوير باستخدام الأشعة فوق البنفسجية والضوء الأزرق والأبيض، وقد تتطلب أجهزة التصوير الكيميائي الحساس أو كشف الفلورة متعددة القنوات.

س3. لماذا المدى الديناميكي مهم؟ لماذا المدى الديناميكي مهم؟

النطاق الديناميكي الكبير من الإشارات يسمح بالتقاط الإشارات الضعيفة والقوية دون تشبع الأقوى. وهذا ينطبق بشكل خاص على التحليل الكمي.

س4. هل يمكن الوثوق بالتعرض التلقائي؟

قد يكون من المفيد تحديد نطاق تعريض ابتدائي. يجب على المشغل أيضا ملاحظة عوامل أخرى مثل التشبع، الخلفية، الإشارات الضعيفة ووضع التصوير.

س5. ما هو أفضل وضع تصوير؟

يعتمد النمط المستخدم على العينة، الصبغة، الملصق، وهدف التحليل. مصدر الضوء، الفلتر، وإعدادات الكاميرا تعتمد على الاختبار.